Introducción
La abeja de la miel, Apis mellifera L., es una especie de gran importancia ecológica y económica a nivel mundial, valorada por su producción de miel y su rol en la polinización. Las poblaciones de Apis mellifera en diversas regiones del mundo, especialmente en América Latina, han experimentado un significativo proceso de africanización. Este fenómeno se originó cuando híbridos de abejas reinas africanas (Apis mellifera scutellata) fueron importadas de Sudáfrica a Brasil y posteriormente escaparon, dando lugar a poblaciones con genotipos híbridos denominadas africanizadas2,3,4.
Contexto de la Africanización
El proceso de africanización se expandió rápidamente por el continente americano. Las abejas africanizadas fueron reportadas cerca de Tapachula, Chiapas, en la zona fronteriza con Guatemala5,6, y su presencia se extendió a regiones como Campeche7. En Yucatán, las abejas silvestres africanizadas (descendientes de A. scutellata) fueron reportadas en 19878. Colombia, por ejemplo, recibió el impacto del proceso de africanización generado en Brasil 20 años antes, después de la expansión de A. mellifera scutellata con los trabajos de Kerr en 1956. Fallas en la manipulación de reinas africanas importadas desencadenaron la fuga de 26 enjambres en 1957, que sin control colonizaron Venezuela, Colombia y Panamá15; a su paso, A. mellifera scutellata se apoderó de los hábitats ocupados hasta entonces por las abejas europeas, cruzándose con ellas o eliminándolas14.
Importancia de la Apicultura y Estudios Genéticos
Desde el punto de vista productivo, las razas de abejas de mayor interés a nivel mundial se han centrado en A. mellifera mellifera L. 1758, A. mellifera ligústica Spinola, 1806, A. mellifera cárnica Pollmann, 1879 y A. mellifera caucásica Gorb, 1758. En Colombia, la apicultura técnica se inició a comienzos de los años 1900, con la importación de abejas Italianas, Caucasianas y Carniolas, incentivando el sector entre 1940 y 1960. Los estudios genéticos, especialmente los basados en el análisis del ADN mitocondrial (ADNmt), son fundamentales para valorar la dinámica poblacional y los efectos de la africanización en la productividad, así como para la identificación de mitotipos y el flujo genético de las poblaciones de abejas16-22.
La caracterización molecular basada en ADN mitocondrial (ADNmt) se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada para el estudio de la diferenciación de subespecies y razas de abejas de los géneros Apis mellifera L. y Melliponinae, entre otros17,18,19,20,21,22,23. El ADNmt de Apis mellifera es de estructura circular, de herencia materna y ha sido usado en la diferenciación y caracterización de reinas de distintas colonias y razas; al evaluar la estructura molecular del ADNmt de la progenie, se logra establecer un marcador genético de referencia a través del cual se puede indagar sobre el origen de una colonia24.
Actualmente, se han identificado para Apis mellifera cinco linajes evolutivos: el linaje A (subespecies africanas como adansonii, unicolor, capensis, montícola y scutellata); el linaje M (razas de Europa Occidental como A. mellifera mellifera, ibérica, sahariensis, major e intermissa); el linaje C (abejas de Europa del Este, entre ellas A. m. ligústica, cárnica, macedónica, cecropia y sícula); el linaje O (subespecies de Oriente Próximo); y el linaje Y (subespecie A. m. yemenitica de Etiopía)15. Cada uno de estos grupos presenta una estructura característica en la secuencia de diferentes regiones de su ADNmt, incluyendo la región intergénica entre los genes del ARNtleu y de la citocromo oxidasa II (COII), sección para la cual se ha observado en el linaje M una diana de la endonucleasa HincII que no se encuentra en el linaje A40. El presente estudio tiene como objetivo caracterizar poblaciones de abejas de Apis mellifera, usando técnicas moleculares de análisis para identificar la variabilidad del ADNmt.
Materiales y Métodos
Muestreo
Se colectaron entre 20 y 30 abejas operarias de los cuadros interiores de 105 colmenas de Apis mellifera de instalaciones productivas correspondientes a las zonas biogeográficas de diversos departamentos colombianos, incluyendo Antioquia, Bolívar, Boyacá, Caldas, Cauca, Cesar, Cundinamarca, Huila, Nariño, Santander del Sur, Tolima y Valle del Cauca. Las muestras fueron preservadas usando etanol al 96 % y almacenadas a -20 ºC hasta su procesamiento y análisis en el laboratorio del Departamento de Zoología y Antropología Física de la Universidad de Murcia.
Adicionalmente, se utilizaron muestras de colonias silvestres (CS) localizadas en diferentes municipios del estado de Tabasco (N=153) para estudios complementarios.
Extracción de ADN
El ADN se obtuvo siguiendo una metodología de extracción con Chelex. Los músculos torácicos de las obreras fueron disecados y secados por media hora en una estufa a 37ºC. La extracción se realizó según un protocolo descrito por Walsh et al. (1991), con ligeras modificaciones. Una vez obtenida la pastilla de ADN, esta se suspendió en 200 μl de agua inyectable y se almacenó a 20 °C. La concentración y pureza del ADN se evaluó a 260 nm.
Amplificación por PCR y Análisis de Restricción
El análisis de ADN se llevó a cabo en un termociclador Perkin Elmer Cetus 480, según el método descrito por Garnery et al. (1993) para amplificar la región intergénica ARNtleu-COII. Se emplearon los cebadores E2 (5’-GGC AGA ATA AGT GCA TTG-3’) y H2 (5’-CAA TAT CAT TGA TGA CC-3’). Los programas de amplificación consistieron en una desnaturalización inicial a 96ºC durante 5 min, seguida de 35 ciclos de 1 min con una temperatura de anillado de 53ºC para la región intergénica ARNtleu-COII, con extensión a 72ºC durante 1 min y desnaturalización de 45 seg a 96ºC, y finalmente 10 min de extensión a 72ºC.
Los productos amplificados se examinaron en gel de agarosa (Nusive, al 5% en tampón TBE 1X). Una alícuota de 10 ml del producto de amplificación por PCR fue digerida con 5 unidades de la enzima DraI a 37ºC por 4-12 horas, teñida con bromuro de etidio y visualizada con luz ultravioleta. La enzima de restricción DraI es específica para la región intergénica ARNtleu-COII37.
Análisis Morfométrico y Estadístico
Para la caracterización morfométrica se empleó una Marca Karl Zeiss con cámara integrada y el software Axiovision LE 472. Se realizaron mediciones de variables como el largo del esternito (V12 LCE) y abdominales. El sistema FABIS22,23 también fue utilizado para el análisis de frecuencias de los morfotipos.
Para establecer las diferencias en la distribución de haplotipos y linajes predominantes, se realizó una prueba de ANOVA, usando el paquete estadístico Statgraphics Centurion XV. Se aplicaron pruebas de Ji2 cuando fue requerido.
Resultados
Caracterización Genética y Distribución de Haplotipos
La estructura genética del ADNmt, con un tamaño aproximado de 16.343 pb, fue estudiada en la región intergénica comprendida entre ARNtleu y COII. La digestión y amplificación del ADN con DraI, seguida de electroforesis en gel de agarosa, reveló secuencias P, Po y P1 (51 a 68pb) y Q (192 a 196 pb), descritas previamente por Cornuet et al. (1991) y Garnery et al. (1993)25,26. La región intergénica se caracteriza por la variabilidad en tamaño, dependiendo del número de copias de la secuencia Q y de la selección completa o parcial de las secuencias tipo P27.
Tras la digestión con la enzima DraI, se identificaron 13 haplotipos en las poblaciones de abejas estudiadas. La distribución de estos haplotipos fue la siguiente:
- Linaje Africano (A): Compuesto por 8 haplotipos (A1, A2, A4, A5, A6, A8, A9 y A13), representando el 90,5% del total. El haplotipo A1 fue el predominante con un 50,0%, presente en el centro de Colombia (Boyacá, Caldas, Cundinamarca y Tolima). Los haplotipos A6 y A4 le siguieron con 16,2% y 11,0% respectivamente.
- Linaje Europeo (M): Incluye 4 haplotipos (M2, M4, M5 y M7), constituyendo el 7,6% del total.
- Linaje C de Europa del Este: Presenta 1 haplotipo (C1), que abarca el 1,9% del total.
El gradiente de distribución del linaje africano estuvo representado principalmente por el haplotipo A1, desde la Costa Caribe colombiana al centro del país, donde se distinguieron además los haplotipos A4 y A6. Los linajes europeos no se vieron representados de manera importante en la población estudiada.
Resultados Morfométricos
Las abejas de Tabasco son más grandes en cuanto a la variable V7 LFPP (2.56 mm). En las 12 variables estudiadas, se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el 67% de las variables (8 de 12) entre los grupos. Por ejemplo, la longitud de la celda de cera (V12 LCE) mostró una correlación significativa (0.5502) con el tamaño general del cuerpo. Sin embargo, otras correlaciones fueron débiles o no significativas, como la débil correlación (0.1541) entre V3 LAPD y V4 NHAP. La variable V10 LBCT se agrupa con la categoría E-CC (1.63), mientras que la categoría A-CS se mostró como el grupo más alejado (5.76).
Coincidencia de Métodos y Contexto Regional
En el estudio de las abejas comerciales de Apis mellifera en el estado de Tabasco, México, se observó que en total, ambos métodos (molecular y morfométrico) coincidieron en 94 identificaciones (61,44 %). Por lo tanto, las abejas CC poseen características morfométricas que tienden a abejas E-BRC. La africanización en el estado de Tabasco fue significativa (Ji2= 52.86, n= 153, P=0.0001), alcanzando hasta un 75% en la subregión Pantanos. En Pantanos (n= 24), 2 colonias (8.33 %) mostraron mitotipos africanos.
Discusión
Dominancia de Linajes Africanos
La presencia de ocho haplotipos A diferentes para las abejas de Colombia sugiere más de un episodio de hibridación, introgresión y expansión del fenómeno de africanización en el territorio colombiano. Este aspecto supone la existencia de otros haplotipos en poblaciones no incluidas en el estudio. La marcada dependencia de colonias africanizadas en la actividad apícola colombiana se evidencia por la débil representación de los linajes europeos en la población estudiada. Los estudios genéticos en poblaciones de abejas han demostrado la dominancia de los genes africanos en las abejas híbridas establecidas en áreas tropicales y subtropicales del Centro, Norte y Sur América28,29,30,31,32,33,34,35, confirmando que los genes africanos son dominantes11. La dominancia de los híbridos de abejas es el resultado de una superioridad competitiva frente al hábitat de trópico.
Consideraciones Metodológicas
Aunque los métodos morfométricos son útiles, pueden llevar a conclusiones erróneas al emplearlos para la determinación de genotipos africanos-europeos. El método molecular se considera más fiable para discriminar genotipos E o A, al no estar afectado por factores ambientales. Sin embargo, en Tabasco, la coincidencia del 61,44% entre ambos métodos indica que la morfometría aún puede aportar información relevante. Es importante considerar que la variabilidad morfométrica entre abejas E/A no está afectada por los factores ambientales, lo que fortalece su uso como complemento.
Implicaciones para la Apicultura
Las diferencias observadas en las poblaciones de abejas pueden estar relacionadas con la intensidad de las prácticas de cambio de reinas y las diferencias en la tecnificación de los apiarios muestreados. La importación de abejas reinas entre los productores de diferentes subregiones también influye sobre el tamaño corporal de las abejas. El método molecular es una herramienta precisa para determinar el origen de las abejas presentes en las colonias y, por ende, de toda la colonia. La identificación de la subespecie Apis mellifera yemenitica de Etiopía con un patrón de restricción Hinc II que no se encuentra en el linaje A40, puede estar reflejando la realidad de la dinámica de entrecruzamientos de las poblaciones. Esto es crucial para la gestión de las colonias de abejas comerciales.
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