El procesamiento de semen y el uso de la inseminación artificial (IA) en especies como la bovina, y principalmente en la industria lechera, es una actividad ampliamente extendida y con buenos resultados biológicos y económicos. La adopción de esta tecnología por la industria ganadera (productores, médicos veterinarios y compañías de genética) ha sido una realidad en la producción bovina.
Para garantizar el éxito de la inseminación artificial, es fundamental una evaluación rigurosa y la correcta contabilización de las dosis de semen. Si bien, ningún examen in vitro tiene alta correlación con la fertilidad, existen pruebas que correctamente interpretadas son útiles, especialmente para detectar partidas con las que no se obtendrán buenos resultados en la IA.
Desarrollo y Uso del Semen Sexado en Bovinos
En lo que se refiere a biotecnologías reproductivas en ganado bovino, la pre-selección del sexo tiene una larga historia, en la cual se ha tratado de separar los espermatozoides con cromosomas “X” y “Y” mediante varias técnicas, basándose en principios de diferencia de masa y motilidad, cinética espermática, cambios en la superficie del espermatozoide y diferencias de volumen; sin embargo, ninguno de estos métodos fue capaz (sedimentación, centrifugación y antisuero Y) de producir una separación eficaz de poblaciones de espermatozoides fértiles.
La predeterminación del sexo se pudo lograr gracias a los avances en la computación, biofísica, biología celular, fisiología reproductiva aplicada, entre otros. A partir del año de 1980 comenzó a aplicarse una técnica denominada citometría de flujo, la cual permitió separar los espermatozoides de acuerdo con sus cromosomas sexuales. Esta técnica se basa en diferenciar los espermatozoides “X” y “Y” en cuanto a su contenido de DNA.
Los eventos más significativos fueron sin lugar a dudas la determinación de la diferencia en el contenido de DNA entre los espermatozoides portadores del cromosoma “Y” o “X”, el flujo de estos en el citómetro, y su separación en los así llamados espermatozoides “Y” y “X”. En el caso de los bovinos, los espermatozoides “X” que producen hembras contienen un promedio de 3.8 % más DNA que los espermatozoides “Y” que producen machos.
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La siguiente tabla muestra las diferencias en el contenido de ADN entre espermatozoides con cromosomas X e Y en diversas especies domésticas:
| Especie | Diferencia de DNA (%) |
|---|---|
| Toros | 3.9 |
| Cerdos | 3.7 |
| Borregos | 4.1 |
| Conejos | 3.9 |
Transcurrieron 20 años para que esta tecnología fuera comercializada para su uso en inseminación artificial (IA) en ganado bovino. La primera producción comercial de semen sexado la realizó la compañía Cogent en el Reino Unido. Aunque tuvo un inicio relativamente lento, aumentó exponencialmente la producción de semen sexado bovino con un estimado de 4 millones de dosis en el 2008.
El semen sexado se comercializaba en pajillas de 0.25 ml a una concentración de 2.1 millones de espermatozoides. Se utilizaba una concentración mínima eficiente, debido a que, al momento de sexar el semen, se perdía aproximadamente un 80 % del eyaculado entre los espermatozoides del sexo no deseado y los espermatozoides que no se lograban diferenciar. Este semen era menos fértil y más delicado que el semen convencional, ya que los espermatozoides eran sometidos a varios procesos para la separación de los espermatozoides con cromosoma “X” y los de cromosoma “Y”, además del proceso de congelado y descongelado.
En la actualidad la tecnología del sexado espermático ha evolucionado, modificando las técnicas, incrementando la velocidad del sexado, disminuyendo el estrés, incrementando la concentración espermática y por ende mejorando los parámetros de viabilidad espermática.
Recolección y Dilución del Semen
Existen varias formas de recolectar semen y el método que se utilice depende en ciertos casos del propósito final de la recolección. En la actualidad se conocen dos técnicas para la recolección de semen en sementales bovinos, la llamada vagina artificial y la estimulación eléctrica o electroeyaculación.
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Vagina Artificial (VA)
En la mayoría de las especies el semen utilizado para la inseminación artificial se obtiene por medio de la técnica de VA, es el método de preferencia debido a su rapidez y limpieza en la operación, además de que no es estresante para el animal y el semen recolectado es de mejor calidad. La VA consiste en una armazón rígida de hule de 40 cm de largo y 6.4 cm de diámetro para toros adultos; los toros jóvenes se pueden iniciarse con vaginas de 20 a 24 cm de largo y 5.1 cm de diámetro.
Electroeyaculación (EE)
Este método permite la obtención de semen de animales no entrenados al uso de la VA, y aunque el método en manos inexpertas es objetable por la frecuencia con que se obtiene semen de baja calidad, en manos de un operador competente es posible obtener semen de buena calidad comparable en todos sentidos con el que se obtiene por medio de VA, aunque constantemente de menor concentración.
Dilución del Semen
La dilución del semen se lleva a cabo en dos partes. La primera incluye la predilución, con 3 ó 4 volúmenes de diluyente por cada volumen de semen. Durante el almacenamiento in vitro los espermatozoides se exponen al plasma seminal a largo plazo. Por lo tanto, es habitual agregar un diluyente al semen, para diluir elementos tóxicos en el plasma seminal, para proporcionar nutrientes para los espermatozoides durante el almacenamiento in vitro y ayuda a amortiguar sus subproductos metabólicos.
La adición del diluyente también permite que el semen se divida en varias dosis, cada una contiene un número específico de espermatozoides que, se ha determinado, es óptimo para una buena fertilidad en hembras inseminadas de cada especie. Generalmente los testículos y las glándulas sexuales accesorias se encuentran libres de bacterias, la contaminación bacteriana del semen ocurre al momento de la recolección o de la manipulación del semen con instrumentos del laboratorio, lo que tiene efectos detrimentales en la viabilidad de los espermatozoides por lo que es de vital importancia la adición de antibióticos al diluyente para el semen.
Los medios de congelación con mayor frecuencia incluyen glicerol como un crioprotector para que los espermatozoides se puedan enfriar más allá de su temperatura normal de -30 a -50°C por minuto. Una vez preparado el diluyente se divide en dos partes iguales, una para la predilución y la primera dilución (Diluyente A), y a la otra se le agrega la cantidad correspondiente de glicerol según el diluyente usado (Diluyente B).
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Evaluación de la Calidad Seminal
La evaluación de la calidad seminal es una consideración importante en el procesamiento de semen. Un examen de calidad seminal debe incorporar tantas medidas útiles de características seminales como sea posible dentro de los límites prácticos, modificando los procedimientos según los propósitos de evaluación.
Examen Macroscópico
- Consistencia: La consistencia del semen depende de la relación de contenido de sus dos constituyentes, espermatozoides y plasma seminal. El examen es un método rápido y simple, en el cual se puede estimar la concentración espermática.
- Apariencia: La apariencia de un eyaculado normal de toro es de color blanco cremoso. Las muestras con concentraciones bajas tienen una apariencia acuosa o menos opaca, una coloración rosácea es indicativa de la presencia de sangre.
- Volumen de eyaculado: El volumen puede medirse directamente con el uso de un tubo de recolección graduado o utilizando una pipeta calibrada. En los bovinos el volumen de eyaculado oscila entre 5 y 15 ml.
- pH: Si el pH del eyaculado es ácido esto no indica baja calidad, pero como la alta actividad espermática de la muestra produce ácido láctico como un producto de desecho del metabolismo, el espermatozoide puede morir si la acidosis no es neutralizada.
Examen Microscópico
Motilidad
Se expresa como el porcentaje de células móviles o vivas. Existen parámetros de motilidad entre los que se incluyen:
- Motilidad Progresiva: Es el porcentaje de espermatozoides que se mueven en línea recta, hacia delante incluyendo velocidad, sin tomar en cuenta las células que se mueven lateralmente o en círculos; se determina al examinar una gota de semen observando las células de manera individual bajo un campo microscópico con un aumento de 40 ó 100X. Este parámetro está correlacionado positivamente con la tasa de fertilidad.
- Motilidad Masal: La motilidad masal u onda de movimiento es el sistema más simple y sencillo que se dispone para evaluar la motilidad del semen fresco. Se determina al examinar una gota de semen sin diluir observando las ondas bajo un campo microscópico con un aumento de 10X.
La escala de vigor espermático es un indicador de la calidad del movimiento:
- Sin movimiento.
- Ligera ondulación o vibración de la cola, sin progresión.
- Progresión lenta, incluyendo detención y comienzo del movimiento.
- Movimiento progresivo continuo y moderada velocidad.
- Movimiento progresivo rápido.
- Movimiento progresivo muy rápido, en el cuál las células son difícil de seguir visualmente.
Un semen de buena calidad recientemente descongelado, generalmente tiene entre un 40 a 50% de espermatozoides con motilidad progresiva y un vigor de 3-4. Luego de dos horas de incubación estos valores disminuyen en un diez a quince por ciento y un punto, respectivamente.
Porcentaje de Espermatozoides Vivos
Se ha utilizado la determinación del porcentaje de espermatozoides vivos en una muestra de semen como verificación de la motilidad y para el control de calidad del semen posdescongelado. La eosina se conoce como tinción diferencial, pues no puede atravesar la membrana de células vivas y sí la de células muertas. Una tinción de contraste, como la nigrosina, el azul de ópalo o el verde rápido, hacen visibles las cabezas no teñidas.
Morfología Espermática
La clasificación morfológica de los espermatozoides ha llegado a ser una parte integral e indispensable en los análisis de semen de todas las especies. La medición de este parámetro es una prueba de control de calidad, dado que si la proporción de espermatozoides anormales es muy alta el semen se considera de baja calidad. El examen morfológico puede alterarse debido a variables como el choque térmico, manejo inapropiado del semen, prolongada inactividad sexual y una exposición a frío o calor extremos durante el almacenamiento de espermatozoides en el epidídimo.
- Anormalidades Primarias: Estas son de origen testicular. Se piensa que ocurrió una falla en el proceso de espermatogénesis y ésta no se corrigió mientras el espermatozoide pasaba por el sistema de conductos. El enrollamiento es la anormalidad más común de cola y de hecho del espermatozoide entero.
- Anormalidades Secundarias: Pueden ser causadas por factores externos o manejo inadecuado.
Integridad del Acrosoma
Un método morfológico de medición de la viabilidad post-descongelación muy valioso, es la determinación de la integridad de los acrosomas, que junto con la evaluación de la motilidad espermática, determinan la viabilidad y fertilidad potencial del semen congelado. Para observar el acrosoma de los espermatozoides, el movimiento de los mismos debe ser detenido; ésto se logra mezclando al semen con glutaraldehído bufferado al 0,2% que fija las membranas y previene su deterioro posterior.
Prueba de Termorresistencia
El semen puede tener una motilidad espermática por arriba del cincuenta por ciento luego de ser descongelado, pero si los espermatozoides presentan lesiones en la membrana plasmática, en el acrosoma, en el núcleo o en otro compartimento celular, puede no ser completamente expresado inmediatamente después de la descongelación. Por tal motivo, el semen debe ser incubado a cierta temperatura por un determinado período, y se observa si el mismo presenta un índice mínimo de viabilidad espermática luego del estrés térmico, así los espermatozoides estarían íntegros y como consecuencia, con capacidad fecundante.
Contabilización de la Concentración Espermática y las Dosis
La concentración espermática de un eyaculado es el producto de la suma de toda una serie de factores y es uno de los parámetros de mayor importancia que se debe de tomar en cuenta para procesar una muestra de semen con fines de IA. La concentración espermática se refiere al número de espermatozoides por mililitro de semen; y será determinada en cada muestra inmediatamente después de la colección.
Técnica de Hemocitómetro
El método hemocitométrico, el cual fue diseñada para contar eritrocitos, es el más utilizado. Consiste en una laminilla especial que tiene dos cámaras de conteo y dos pipetas para diferentes diluciones. Las cámaras de conteo tienen 0.1 mm de profundidad y una cuadricula graduada en el fondo con una área de 1 mm2. Este cuadro se divide en 25 cuadros más pequeños.
Para la determinación de la concentración espermática, se toma un volumen de 5 µl de semen con pipeta automática y se lo diluye en 500 µl de Azul de Metileno en un tubo de Kahn (vidrio). Se homogeniza, se descartan las 3 o 4 primeras gotas y luego se deposita una gota en el hemocitómetro. Se cuentan los espermatozoides que se encuentran dentro de los 4 cuadrados primarios que están en los extremos del cuadriculado de la cámara. Estos son los cuadrados donde se cuentan los glóbulos blancos y tienen 1 mm2 de superficie.
El número total de espermatozoides se divide por 4 para obtener el número promedio de espermatozoides por mm2. Este número se multiplica por 10, porque la altura de la cámara es de 0,1 mm y tenemos que calcular la cantidad de espermatozoides por mm3 de semen diluido. Luego se multiplica por 100 que es el factor por el cual hemos diluido el semen. Este resultado hay que multiplicarlo por el volumen de semen según sea una pajuela o una pastilla:
- Para pajuela (volumen 0,5 ml): N° de espermatozoides promedio x 10 x 100 x 500 = N° de células por dosis.
- Para pastillas (rediluidas en 1 ml): N° de espermatozoides promedio x 10 x 100 x 1000 = N° de células por dosis.
Una vez calculado el N° de células por dosis, de acuerdo al % de motilidad progresiva a la 0 hora, se determina la cantidad de células mótiles por dosis.
Técnica del Espectrofotómetro
La otra técnica es la del Espectrofotómetro, el procedimiento se basa en la absorción de luz que pasa a través de una serie de lentes y filtros de una muestra de semen diluido. La luz que pasa se mide con un galvanómetro.
Importancia del Número de Espermatozoides por Dosis
Un criterio de calidad muy importante es el número de espermatozoides por dosis de semen, tanto cuando se venden tubos de semen a los clientes como cuando se utilizan en la propia granja. Una dosis de semen debe contener un número mínimo de espermatozoides para garantizar que la inseminación de una cerda tenga éxito. El número de espermatozoides por dosis de semen es el resultado de una larga cadena de producción con varias etapas.
La existencia de numerosas fuentes de variación de la fertilidad (toro, eyaculado, número de espermatozoides, hembra, etc.) impone que el centro de inseminación artificial deba incluir en la dosis de semen congelado un número de espermatozoides bastante elevado. En la actualidad, se dispone de nuevas técnicas analíticas basadas en programas informáticos (los llamados instrumentos CASA), que permiten una valoración objetiva del semen. Este equipo es capaz de evaluar con precisión la concentración espermática, el número total de espermatozoides, la motilidad y el vigor espermático.
Criopreservación y Almacenamiento del Semen
Durante los últimos 40 años, el desarrollo y uso global de IA con semen preservado ha crecido exponencialmente, particularmente en ganado lechero (> 200 millones de dosis de semen congelado). El semen bovino se criopreserva utilizando métodos estandarizados para la dilución, enfriamiento, congelación y descongelación en todo el mundo, con solo diferencias sutiles entre Bos taurus y Bos indicus.
Todo el procedimiento de congelación puede durar, dependiendo de la especie, entre 2 y 9 horas desde la recolección de semen hasta el almacenamiento de las dosis congeladas en N2 líquido. Sin embargo, incluso para el ganado, los métodos actuales para la congelación de semen son subóptimos, pues su vida útil es limitada, disminuye la fertilidad durante el almacenamiento y puede presentar daños debido a cambios de temperatura, presión o manipulación. La supervivencia de los espermatozoides potencialmente fértiles es baja y su posterior fertilidad, a menudo, es inferior al 50%.
La preservación del semen se realiza utilizando termos de nitrógeno de acero inoxidable con diferentes capacidades cuya finalidad es evitar que el nitrógeno se evapore. Dentro de las canastillas de acero se depositan los bastidores y sobre ellos se montan los goblets. Cada bastidor tiene la capacidad para dos goblets y cada uno puede contener hasta cinco pajillas, por lo tanto, cada bastidor contendrá diez pajillas.
La identificación de las pajillas se realiza en la parte superior del bastidor el cual debe estar marcado con los datos del animal (número, clave, nombre) y la fecha de procesamiento del semen.
Criterios de Evaluación y Normas Mínimas Recomendadas
Los laboratorios de evaluación de semen utilizan protocolos estandarizados para asegurar la calidad de las dosis. A continuación, se detallan las normas mínimas recomendadas:
| Parámetro | Momento de Evaluación | Valor Mínimo Recomendado |
|---|---|---|
| Viabilidad post-descongelación (Motilidad Progresiva) | 0 horas | ≥ 25 % (Vigor 3) |
| 2 horas de incubación a 37 °C | ≥ 15 % (Vigor 2) | |
| Integridad del Acrosoma | 0 horas | ≥ 50 % de espermatozoides con acrosomas intactos |
| 2 horas de incubación a 37 °C | ≥ 35 % de espermatozoides con acrosomas intactos |
Otro parámetro muy importante a tener en cuenta a la hora de clasificar una muestra de semen, es determinar el número de espermatozoides con motilidad progresiva por dosis. Esta característica evaluada surge de multiplicar el número de espermatozoides totales por el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva a la hora cero post-descongelación.
Control Bacteriológico
Para que el riesgo sanitario de la IA sea cero, el semen debe estar libre de todo agente patógeno transmisible. Este debería ser el primer criterio de calidad exigido por los compradores de semen, ya que una cantidad importante de enfermedades pueden ser transmitidas por esta vía; tales como: Rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR), Diarrea Viral Bovina/Enfermedad de las Mucosas (DVB), Brucelosis, Leptospirosis, Campilobacteriosis, Tricomoniasis, Histofilosis, Clamidiasis, entre otras.
En cuanto a la calidad bacteriológica del semen, es sabido que existen microorganismos banales en el medio ambiente donde se encuentran los toros dadores que pueden actuar como potenciales contaminantes del mismo. El objetivo es que su presencia, no sobrepase las 500 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por unidad de inseminación.
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