La esencia de la cuantificación de la biblioteca NGS es la cuantificación de ácidos nucleicos (ADN o ARN). El análisis preciso de la cuantificación de la biblioteca NGS es crucial para obtener datos de secuenciación de alta calidad. Si la concentración cuantitativa de la biblioteca NGS es alta, el rendimiento de los datos de secuenciación puede ser bajo debido a una agrupación insuficiente. Sin embargo, una concentración cuantitativa baja puede provocar interferencias de señales entre agrupaciones para producir datos de baja calidad e incluso provocar un fallo de secuenciación.
Además, con el aumento del flujo de secuenciación de los secuenciadores, a menudo se combinan múltiples bibliotecas NGS para la secuenciación. De acuerdo con los requisitos del tamaño de los datos de secuenciación, las bibliotecas NGS con las cantidades molares correspondientes se mezclan en función de los resultados cuantitativos para estabilizar la salida del tamaño de cada dato de muestra. Por lo tanto, la cuantificación precisa de las bibliotecas NGS es crucial.
Principales Métodos de Cuantificación de Ácidos Nucleicos
En la actualidad, existen dos métodos principales de cuantificación de la biblioteca NGS: el método de absorción ultravioleta y el método del tinte fluorescente. La precisión cuantitativa y el costo de estos dos métodos son diferentes.
Cuantificación mediante Absorción Ultravioleta (Espectrofotometría)
NanoDrop es un instrumento de cuantificación de ADN diseñado según el principio de absorción ultravioleta. El principio del método de absorción ultravioleta es que hay bases de purina y pirimidina en los componentes de ácido nucleico, y estas bases tienen dobles enlaces conjugados. Hay una fuerte absorción de luz a 250-280 nm en la región UV, y el valor máximo de absorción es de aproximadamente 260 nm. Por lo tanto, la absorción UV de ácido nucleico se puede utilizar para la cuantificación de concentración.
Los ácidos nucleicos se han cuantificado tradicionalmente determinando la absorbancia UV en tres longitudes de onda analíticas: 230 nm, 260 nm y 280 nm. Estas mediciones de absorbancia permiten a los científicos medir la concentración de ácido nucleico y tener una indicación de la pureza de la muestra. Las ventajas de este método de cuantificación de ácido nucleico son que es simple, directo y consume solo un pequeño volumen de su muestra. NanoDrop es simple y rápido de operar, pero no puede distinguir entre ADN, ARN, ácidos nucleicos degradados, nucleótidos libres y otras impurezas. No es adecuado para obtener datos cuantitativos precisos de la biblioteca.
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Avances en Espectrofotometría de Microvolumen y Funcionalidades de NanoDrop
Un gran avance en la aplicación del método se logró con la introducción de espectrofotómetros de microvolumen, que permiten la medición de pequeñas gotas de la muestra (típicamente 1 µL). Por lo tanto, los espectrofotómetros de cubeta para la cuantificación de DNA se han abandonado en gran medida, y los espectrómetros de microvolumen son el instrumento de elección para las mediciones de absorción de una sola muestra. Cuantificar DNA con un espectrofotómetro de microvolumen es simple y directo, pero las muestras deben medirse individualmente con una corta etapa de limpieza entre muestras, lo que consume bastante tiempo cuando se necesita cuantificar un gran número de muestras.
Con los avances en el software UV-Vis, los investigadores ahora pueden cuantificar selectivamente la absorbancia de ácidos nucleicos en presencia de contaminantes químicos y de ácidos nucleicos. El software Thermo Scientific Acclaro Intelligence Technology (estándar en nuestros espectrofotómetros y fluorómetros NanoDrop Ultra y espectrofotómetros NanoDrop Eight) utiliza datos de espectro completo y algoritmos avanzados para identificar contaminantes comunes de ácidos nucleicos y proporcionar concentraciones corregidas de ácidos nucleicos. Los algoritmos de Acclaro pueden detectar contaminación de dsDNA en ARN y contaminación de ARN en dsDNA.
La tecnología Acclaro Sample Intelligence permite a los espectrofotómetros y fluorómetros de microvolumen NanoDrop Ultra, y a los espectrofotómetros de microvolumen NanoDrop Eight, proporcionar más información sobre la calidad de la muestra identificando contaminantes comunes y entregando concentraciones de muestra verdaderas. Acclaro software incorpora algoritmos que se basan en una biblioteca de referencia de espectros. Por ejemplo, el software Acclaro ha marcado una muestra de dsDNA (icono amarillo) porque está contaminada con proteínas. Las bibliotecas de referencia de Acclaro actualmente admiten la detección de proteínas, fenol, clorhidrato de guanidina y ARN en muestras de dsDNA. También admiten la detección de proteínas, fenol, isotiocianato de guanidina y dsDNA en muestras de ARN. Finalmente, permiten la detección de ADN en muestras de proteínas.
La identificación de contaminantes brinda a los investigadores dos importantes datos. Primero, identifica contaminantes específicos que probablemente estén presentes en la muestra. Esta información puede ayudar a los científicos a solucionar extracciones o purificaciones difíciles y a tomar decisiones con respecto al uso de la muestra en experimentos posteriores. En segundo lugar, proporciona una concentración corregida del analito. Por ejemplo, la contaminación por ARN en las preparaciones de ADN genómico es un problema común en los flujos de trabajo de biología molecular. En la espectrofotometría tradicional, la presencia de ARN copurificado puede inflar artificialmente la concentración de ADN.
Los espectrofotómetros y fluorómetros NanoDrop Ultra, y los espectrofotómetros NanoDrop Eight, están bien equipados para cuantificar y calificar muestras de ácido nucleico como un paso de control de calidad para ensayos de RT-qPCR posteriores. La tecnología Acclaro Sample Intelligence, integrada en los instrumentos NanoDrop Ultra y Eight, identifica la presencia de contaminantes comunes en las muestras y calcula una concentración aproximada del contaminante. El software Acclaro Pro tiene las mismas capacidades que Acclaro Sample Intelligence Technology, al tiempo que desbloquea una calibración adicional de fábrica, que calibra el instrumento para una precisión excepcional dentro de las aplicaciones de Acclaro Pro. Permite mediciones de absorbancia con un error de ± 5% hasta 550 Abs (equivalente a 10 mm), hasta 400 mg/mL de IgG o 18,000 ng/µL.
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Cuantificación de Proteínas con NanoDrop
Los científicos pueden utilizar los instrumentos NanoDrop para cuantificar el contenido de proteínas en su muestra utilizando mediciones directas o indirectas. La proteína A280 es una aplicación de medición directa que calcula la concentración de proteína basándose directamente en la absorbancia de la muestra a 280 o 205 nm y el coeficiente de extinción específico de la proteína. Las mediciones directas son una opción popular para los investigadores porque son simples de realizar, no requieren reactivos ni estándares y consumen muy poca muestra.
Las muestras de proteínas purificadas se pueden medir con precisión utilizando la absorbancia directa a 280 nm, lo que se debe principalmente a las cadenas aromáticas de los aminoácidos Trp y Tyr. A diferencia de los ácidos nucleicos, cada proteína pura tiene un coeficiente de extinción de Beer-Lambert único basado en su secuencia de aminoácidos. Dado que la cadena principal de péptidos de una proteína absorbe luz a 190-220 nm, los péptidos que carecen de residuos de Tyr o Trp pueden cuantificarse utilizando la absorbancia a 205 nm. Las proteínas en mezclas complejas, como extractos celulares o lisados, se miden mejor utilizando un ensayo colorimétrico de proteínas como el Bradford, BCA, Lowry o Pierce 660nm. Estos ensayos proporcionan concentraciones específicas de proteínas, evitando la absorbancia de los componentes celulares que absorben en el rango UV e inflarían el A280.
Otras Aplicaciones de NanoDrop
El crecimiento de cultivos bacterianos se puede monitorear midiendo su densidad óptica a 600 nm (OD600). Se puede medir OD600 en los espectrofotómetros y fluorómetros NanoDrop Ultra, y en los espectrofotómetros NanoDrop Eight, utilizando la aplicación preprogramada OD600. Los espectrofotómetros y fluorómetros NanoDrop vienen con métodos precargados para la cuantificación de ácidos nucleicos (como dsDNA, ssDNA y RNA) y la cuantificación de proteínas (como A280, BCA y Bradford). También puede crear métodos personalizados en los espectrofotómetros y fluorómetros NanoDrop Ultra o en el espectrofotómetro NanoDrop Eight para realizar mediciones UV-Vis u otras mediciones definidas por el usuario según sus necesidades, permitiendo que el instrumento funcione como un espectrofotómetro convencional.
Cuantificación mediante Fluorescencia (Fluorometría)
El método qubit es el principal recomendado aquí. No hay duda de que Qubit es mejor que Nanodrop. La cuantificación Qubit es la mejor opción para la cuantificación precisa de la biblioteca NGS, especialmente para la cuantificación de ADN.
¿Cómo funciona Qubit?
El principio de Qubit es utilizar colorantes fluorescentes para unirse a las moléculas de ADN y emitir fluorescencia, y luego medir la intensidad de la fluorescencia para obtener la concentración de ácido nucleico. Los colorantes fluorescentes emiten fluorescencia solo después de unirse a la doble cadena de ADN, y la fluorescencia resultante es proporcional a la concentración de ADN.
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Características Clave de la Cuantificación Qubit
- Especificidad: Los colorantes fluorescentes se unen preferentemente al dsADN.
- Longitud del fragmento de ADN: No hay ninguna restricción específica.
- Exactitud: Alta.
- Requisitos de tamaño de muestra: Diluir muestras de 1-20 μl.
- Rango de concentración de detección: 0.2-100 ng.
- Número de estándares: Generalmente dos.
- Tiempo de operación manual: Establezca el tiempo en 5 minutos y el tiempo de medición para una sola muestra en 3 s.
- Tiempo de detección total: 5 min-30 min (dependiendo del tamaño de la muestra).
- Instrumento aplicable: Qubit (3.0/4.0); Lector de microplacas con la longitud de onda correspondiente.
- Escena aplicable: Cuantificación de dsDNA; cuantificación de dsDNA en la construcción de bibliotecas NGS y cuantificación rápida en bibliotecas convencionales.
Productos Qubit Suministrados por Yeasen
El 1×dsDNA HS Assay Kit para Qubit® (Cat#: 12642ES), desarrollado sobre la base de El kit de ensayo HS de dsDNA para Qubit® (n.° de cat.: 12640ES) es una solución de premezcla Qubit lista para usar que permite prediluir los colorantes concentrados del kit original para obtener una solución de trabajo. Al utilizarlo, solo es necesario mezclar el líquido de trabajo con la muestra que se va a analizar para determinar la concentración de la muestra mediante el fluorómetro Qubit®, que es más cómodo de usar.
Las características de este producto incluyen:
- Simple y fácil de operar: líquido premezclado listo para usar, sin necesidad de preparar líquido de trabajo, operación simple, ahorro cuantitativo de más tiempo.
- Sensibilidad ultra alta: cuantificación precisa de dilución en gradiente de 64x, 0,2-100 ng de dsDNA tiene una buena relación lineal.
- Súper especificidad: detección específica de dsDNA, tiene excelente tolerancia a algunos contaminantes convencionales.
- Velocidad de unión rápida del tinte: la saturación se puede alcanzar en 2 minutos, por lo que no es necesario esperar una lectura rápida de resultados cuantitativos precisos.
- Alta estabilidad: la señal de fluorescencia duró 3 horas y la precisión cuantitativa no se vio afectada después de 20 días a temperatura ambiente. Los resultados muestran que se mantiene estable después de almacenarse a temperatura ambiente durante 2 semanas (la desviación entre el valor medido y el valor teórico fue <10%). Superestabilidad, alta relevancia de los resultados de la prueba dentro del período de validez.
Qubit Flex Fluorometer: Versatilidad y Eficiencia
El Qubit Flex Fluorometer está diseñado para la cuantificación altamente precisa y sensible de ADN, ARN, microARN, proteínas y endotoxinas. Este fluorómetro de mesa ofrece la flexibilidad de medir directamente la fluorescencia de hasta ocho muestras simultáneamente, lo que reduce la variabilidad del ensayo. Combinado con reactivos Qubit, el Qubit Flex Fluorometer forma parte de un flujo de trabajo optimizado que genera resultados altamente precisos y reproducibles.
El fluorómetro Qubit Flex tiene la flexibilidad de medir múltiples muestras de ADN, ARN y proteínas hasta un 50% más rápido que los lectores de una sola muestra. Además de ahorrar tiempo, la capacidad de medir ocho muestras simultáneamente reduce la variabilidad, lo que resulta en datos altamente reproducibles. El fluorómetro Qubit Flex incluye calculadoras de reactivos, rango y molaridad, lo que reduce aún más el tiempo de resultados. Las calculadoras de reactivos y rango ayudan a determinar qué reactivo y cantidad de muestra usar para cuantificar efectivamente la cantidad de ADN, ARN o proteína. La calculadora de molaridad le permite calcular la molaridad de sus muestras en función de la longitud del ácido nucleico y la concentración medida. Permite resultados más precisos que la absorbancia UV a bajas concentraciones. El fluorómetro Qubit Flex, cuidadosamente diseñado, requiere volúmenes de muestra de solo 1-20 µL.
Consideraciones para la Elección del Equipo de Cuantificación de ADN
Los métodos más comunes para la cuantificación del DNA son la espectrofotometría UV y la medición de fluorescencia de los colorantes de unión al DNA. El primer método requiere un sistema de medición que sea adecuado para la medición de la absorción y el último requiere un dispositivo que pueda usarse para la medición de la fluorescencia. Por lo tanto, la primera decisión antes de elegir un instrumento es el método de cuantificación de DNA que se utilizará.
Los lectores de microplacas pueden medir muchas muestras en poco tiempo: Los formatos de placa típicos son de 96 y 384 pocillos, pero algunos lectores también pueden leer placas con 1536 pocillos o más. Sin embargo, tienen algunas limitaciones en el cálculo de las concentraciones de ADN en comparación con los espectrofotómetros de microvolumen: Requieren volúmenes de muestra más grandes para la medición. La longitud de la paso, que es un factor en la fórmula para calcular la concentración de DNA, depende de la geometría del pocillo y el volumen de la muestra. Como la fórmula para calcular la concentración de DNA requiere una longitud de trayectoria de 1 cm, la medición en microplacas requiere la corrección de la longitud de paso.
Para una cuantificación práctica de DNA en nuestros lectores de microplacas, ofrecemos la Placa µDrop, que incluye archivos de parámetros para facilitar la medición y el cálculo utilizando el software LightCompass. Si necesita una alta sensibilidad o especificidad en sus mediciones de cuantificación de DNA, debe cambiar de absorbancia a fluorescencia, lo que requiere un fluorímetro. Para los laboratorios que utilizan fluorescencia para otras aplicaciones, un lector de microplacas es una inversión mucho mejor. Los lectores de fluorescencia en microplaca ofrecen un rendimiento mucho mayor y más flexibilidad que los fluorímetros compactos de tubo. La cuantificación de la fluorescencia del DNA no requiere corrección de la longitud de la trayectoria porque se usa una curva estándar para calcular las concentraciones en lugar de la fórmula de Beer-Lambert.
En cuanto a la elección del lector de microplacas, la mayoría de los lectores son adecuados si son capaces de establecer las longitudes de onda de excitación y emisión recomendadas. Los instrumentos basados en filtros ofrecen una mayor sensibilidad, mientras que los instrumentos basados en monocromadores proporcionan más flexibilidad. Muchos colorantes fluorescentes comunes para la cuantificación del DNA se pueden medir con los filtros estándar de fluoresceína, pero antes de comprar un kit de cuantificación de DNA, verifique si su instrumento tiene filtros adecuados.
Los investigadores de la Universidad de Queensland, en Australia, han desarrollado un dispositivo abierto y accesible que permite medir ADN de manera precisa y económica, utilizando tecnología de impresión 3D. El dispositivo funciona como un fluorómetro, un instrumento utilizado para cuantificar material genético mediante fluorescencia, técnica común en procesos como la secuenciación de ADN. Diseñado por el Dr. Will Anderson del Instituto Australiano de Bioingeniería y Nanotecnología, el DIYNAFLUOR ha demostrado una precisión comparable a modelos comerciales que superan los miles de dólares.
Si la muestra no es prístina y desea determinar la concentración de ADN genómico humano presente, deberá utilizar un sistema de cuantificación de ADN específico para humanos. En ciencias forenses, los sistemas más comunes se basan en PCR en tiempo real y utilizan sondas o cebadores de oligonucleótidos marcados con fluorescencia para detectar y cuantificar un producto de PCR en tiempo real. La amplificación del objetivo autosómico determina la concentración total de ADN humano, y la amplificación Y determina la concentración de ADN humano masculino en una muestra extraída.
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