Las hidrogenasas catalizan la interconversión de dihidrógeno (H2) y protones/electrones, siendo esenciales en el metabolismo de diversos microorganismos. La comunidad científica ha identificado y estudiado extensamente dos clases principales de estas enzimas: las hidrogenasas de hierro (Fe-solamente) y las hidrogenasas de níquel-hierro (NiFe), cada una con propiedades estructurales y catalíticas únicas.
Hidrogenasas de Hierro
Las hidrogenasas de hierro son conocidas por sus elevadas actividades, superando generalmente a las enzimas NiFe, con números de recambio que se aproximan a 106 min-1. Han sido aisladas de diversos géneros de bacterias anaerobias, incluyendo Desulfovibrio, Megasphaera, Clostridium y Acetobacterium. Entre estas, las enzimas de Desulfovibrio vulgaris, Megasphaera elsdenii, Clostridium pasteurianum (que presenta dos hidrogenasas distintas) y Acetobacterium woodii han sido las más caracterizadas, con especial énfasis en las de D. vulgaris y C. pasteurianum. Aunque Acetobacterium y Clostridium comparten una relación cercana, los otros organismos mantienen parentescos más distantes. A pesar de estas diferencias filogenéticas, sus hidrogenasas exhiben similitudes estructurales y funcionales notables.
Estructura y Grupos Activos
Todas las hidrogenasas de hierro se caracterizan por contener dos tipos distintos de conglomerados hierro-azufre, designados como grupos F y H. Se cree que los grupos F son del tipo Fe4S4+/2+ tiocubane y, cuando la enzima se encuentra en su forma reducida, generan señales de EPR con S = 1/2. En contraste, el grupo H, considerado el sitio de activación del hidrógeno, produce una señal de EPR exclusivamente en la forma oxidada de la enzima. Las señales de EPR del clúster H de todas estas enzimas son bastante parecidas (g = 2.09, 2.04, 2.00) y difieren significativamente de las señales de otros conglomerados de hierro-sulfuro oxidados (como los clústeres Fe3S4 e HIPIPs), siendo observables a temperaturas relativamente altas (> 100 K).
Inhibición y Formación de Complejos
El monóxido de carbono (CO) actúa como un potente inhibidor de las hidrogenasas de hierro, aunque esta característica no se ha reportado para la enzima de M. elsdenii. La exposición de las enzimas de D. vulgaris y de ambas hidrogenasas de C. pasteurianum a monóxido de carbono resulta en la formación de una especie fotosensible que exhibe una señal de EPR modificada del grupo H. Es relevante destacar que, si bien el CO en exceso es un inhibidor potente, el complejo hidrogenasa I-CO es sorprendentemente activo. En el caso de la hidrogenasa II, el complejo CO se disocia tras la exposición a H2, lo que restaura la enzima a su estado "activo". De manera interesante, las enzimas de C. pasteurianum también pueden formar complejos con O2, un proceso que se distingue de la desactivación enzimática por una exposición prolongada a O2. Estos complejos de O2 presentan señales de EPR fotosensibles muy similares a las observadas en el complejo con CO.
Hidrogenasas I y II de Clostridium pasteurianum
Las hidrogenasas I y II de C. pasteurianum han sido extensamente investigadas y se consideran modelos prototípicos de hidrogenasas de hierro. La hidrogenasa I es capaz de catalizar tanto la oxidación como la evolución de H2, mientras que la hidrogenasa II muestra una preferencia por la oxidación de H2.
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Estas dos enzimas difieren en su contenido de hierro, información que ha sido reevaluada recientemente mediante análisis de aminoácidos:
| Hidrogenasa | Átomos de Hierro (total) | Grupos F (Fe) | Grupo H (Fe) |
|---|---|---|---|
| Hidrogenasa I | ~20 | Cuatro (16) | Uno (6) |
| Hidrogenasa II | ~14 | Dos | Uno |
El espectro EPR de la hidrogenasa I reducida es característico de los grupos Fe4S4+ (interaccionantes) y se integra a 3 o 4 espinas por proteína. Estudios recientes de espectroscopias MCD y EPR han revelado la presencia de cantidades significativas de una especie S = 3/2 en la hidrogenasa I reducida. Esta señal se integra en aproximadamente un espín por molécula y probablemente se origina de un estado S = 3/2 de un clúster Fe4S4. Por otro lado, los grupos F de la hidrogenasa II producen dos señales EPR diferentes, cada una integrándose a un giro por molécula de proteína, y correspondientes a sitios con distintos potenciales redox. Esto sugiere que la hidrogenasa II contiene dos grupos F diferentes, denominados F y F'.
Comportamiento Redox y Potenciales
El comportamiento redox de los centros F y H en las hidrogenasas I y II concuerda fuertemente con sus respectivas funciones. Se postula que los grupos F median la transferencia intermolecular de electrones con el portador externo e intramolecularmente con el centro H. Los potenciales redox de estos centros son los siguientes:
| Hidrogenasa | Centro | Potencial Redox (E°' a pH 8) |
|---|---|---|
| Hidrogenasa I | F y H | ~ -400 mV |
| Hidrogenasa II | F | -180 mV |
| F' | > -300 mV |
En el caso de la hidrogenasa I reversible, los centros F y H poseen potenciales redox idénticos (aproximadamente -400 mV a pH 8), similares al del electrodo de hidrógeno (-480 mV a pH 8). Esto permite que los electrones fluyan en ambas direcciones al emplear un mediador como el metilviologeno (E°' = -440 mV a pH 8) como aceptor externo.
Análisis Espectroscópicos del Clúster H
Se han documentado estudios de espectroscopia de Mössbauer para ambas hidrogenasas I y II. Los resultados son consistentes entre ambas enzimas, aunque mejor definidos para la hidrogenasa II debido a su menor número de conglomerados. El clúster H parece contener solo dos tipos de hierro, en una proporción de 2:1, con divisiones cuadrupolares que evocan a los clústeres Fe3S4. Se ha confirmado que el clúster oxidado es un sistema S = 1/2, similar a los clústeres Fe3S4, y que el clúster H reducido es un sistema S = 0, lo cual contrasta con los clústeres Fe3S4 reducidos que tienen S = 2. Complementariamente, la espectroscopia ENDOR de proteína enriquecida en Fe57 ha revelado al menos dos tipos distintos de hierro en el grupo H de la hidrogenasa II, con acoplamientos hiperfinos metálicos de aproximadamente 18 y 7 MHz.
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Las señales de EPR del grupo H de las hidrogenasas II y I experimentan cambios al unirse al monóxido de carbono. Aunque las señales de las enzimas no complejadas son bastante similares, las de las especies unidas a CO son muy diferentes (con la salvedad de que la hidrogenasa I de C. pasteurianum unida a CO presenta un EPR similar al de la enzima D. vulgaris unida a CO). Al generar el complejo con 13C-CO enriquecido, la señal EPR de la hidrogenasa II muestra un acoplamiento hiperfino resuelto de 13C (A av = 33 MHz) a un solo núcleo de 13C, lo que indica la unión de un único CO, presumiblemente como un carbonilo metálico. Recientemente, la espectroscopia ESEEM de la hidrogenasa I ha detectado la presencia de un nitrógeno cercano, que podría funcionar como un ligando para el clúster H. Este nitrógeno exhibe un acoplamiento de cuadrupolo eléctrico nuclear inusualmente grande.
Los resultados de EXAFS en la hidrogenasa II son particularmente intrigantes. Los EXAFS de la hidrogenasa I oxidada revelaron interacciones hierro-azufre y hierro-hierro; la última, a aproximadamente 2.7 Å, se halla a una distancia típica de los conglomerados Fe2S2, Fe3S4 y Fe4S4. Sin embargo, la enzima reducida mostró una interacción adicional de Fe-Fe a 3.3 Å. Esta separación de Fe-Fe no ha sido observada en ninguno de los compuestos modelo de FeS reportados hasta la fecha. La aparición de la interacción de 3.3 Å sugiere un cambio estructural en el clúster H tras la reducción, subrayando una vez más la singularidad de su estructura y reactividad. Estos hallazgos resaltan que los grupos H de las hidrogenasas constituyen una clase única de conglomerados de hierro-azufre.
Hidrogenasas de Níquel-Hierro (NiFe)
La identificación del níquel en las hidrogenasas es un descubrimiento relativamente reciente. Durante años, las preparaciones purificadas de estas enzimas activas fueron objeto de intensos estudios antes de que su contenido de Ni se revelara a través de investigaciones nutricionales. A diferencia de las hidrogenasas de hierro, las enzimas NiFe presentan una mayor diversidad en su composición, pesos moleculares, comportamiento de activación y potenciales redox. No obstante, existe un patrón común en la composición proteica de las hidrogenasas de Ni, al que muchas, aunque no todas, parecen ajustarse, especialmente aquellas provenientes de eubacterias púrpuras.
Composición y el Sitio Activo de Níquel
Las hidrogenasas NiFe típicamente están compuestas por dos subunidades proteicas, con masas moleculares aproximadas de 30 y 60 kDa, siendo probable que el níquel resida en la subunidad más grande. La hidrogenasa de la bacteria reductora de sulfato Desulfovibrio gigas es una de las mejor estudiadas y sirve como un modelo clave en este campo. La hidrogenasa de D. gigas contiene un único átomo de Ni, junto con dos grupos Fe4S4 y un clúster Fe3S4. El sitio de níquel es de interés primordial, ya que se considera el sitio de activación de H2.
Señales EPR de Níquel
Las señales de EPR atribuibles al Ni mononuclear, confirmadas por el enriquecimiento con 61Ni (I = 3/2), han sido cruciales en numerosas investigaciones sobre el papel del Ni en las hidrogenasas. Se han identificado tres señales principales de Ni EPR, denominadas Ni-A, Ni-B y Ni-C. Sus valores g principales son: 2.32, 2.24 y 2.01 para Ni-A; 2.35, 2.16 y 2.01 para Ni-B; y 2.19, 2.15 y 2.01 para Ni-C. Se postula que Ni-C está asociado con la forma enzimática más activa (conocida como activa), mientras que las otras dos señales provienen de formas enzimáticas menos activas.
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En la enzima preparada aeróbicamente, la señal de Ni-A EPR se observa de manera característica. Con la reducción de hidrógeno, esta señal de Ni-A EPR desaparece, y la enzima transita a una forma de mayor actividad (la señal de Ni-B surge de la reoxidación de esta forma). Una reducción progresiva adicional de la enzima da lugar a la señal de Ni-C EPR, que eventualmente también se desvanece. Estas propiedades redox indican que Ni-C se origina de un estado de oxidación enzimática intermedia. Aunque las señales de Ni-A y Ni-B EPR casi con certeza corresponden a Ni(III) de bajo espín, el estado de oxidación formal de Ni-C es menos claro. Se han propuesto tanto un sitio Ni(I) como un hidruro de Ni(III), inclinándose actualmente la balanza hacia la primera alternativa debido a la aparente ausencia del fuerte acoplamiento hiperfino de protones esperado para la segunda. En su estado completamente reducido, Ni-C se convierte en una especie silente a EPR, lo que ha llevado a sugerencias de que podría ser Ni(0), Ni(II) o un hidruro de Ni(II).
Entorno de Coordinación del Níquel
La información detallada sobre el entorno de coordinación del níquel se ha derivado de espectroscopias de absorción de rayos X y EPR. Los EXAFS de borde K de Ni en diversas hidrogenasas y la espectroscopia EPR de hidrogenasa de Wolinella succinogenes enriquecida con 33S, han confirmado la presencia de coordinación de azufre al níquel. Una investigación reciente de espectroscopia de absorción de rayos X en la hidrogenasa de D. baculatus (que contiene selenio), empleando tanto Ni como Se EXAFS, sugiere la coordinación de selenocisteína al Ni. Asimismo, la espectroscopia ESEEM de las señales Ni-A y Ni-C EPR indica un acoplamiento de 14N, que probablemente proviene de un ligando de histidina unido al Ni. Es notable que Ni-C, a diferencia de Ni-A, exhibe un acoplamiento a un protón que puede intercambiarse con el agua solvente.
A pesar de los extensos estudios realizados hasta la fecha, persisten numerosas interrogantes sin resolver sobre el mecanismo de las hidrogenasas NiFe, lo que las convierte en un área fructífera para futuras investigaciones.