La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia está directamente relacionada con las propiedades intrínsecas del analito, con su concentración y con la longitud de la trayectoria del haz de radiación al atravesar la muestra. En resumen, la ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. La Ley de Lambert-Beer introduce el concepto de absorbancia (A) de una muestra como $A=log\frac{I}{I_0}$. Donde $I_0$ representa la intensidad de la luz incidente e I la intensidad de la luz que atraviesa la celda. También podemos expresar la absorbancia en función de la longitud de la cubeta y de la concentración de soluto.
Cuando el haz luminoso de un espectrofotómetro atraviesa una solución activa UV-vis, la intensidad del haz luminoso disminuye. La disminución de la intensidad luminosa del haz de luz al atravesar una solución también se denomina atenuación. Cuando la muestra absorbe la luz de un espectrofotómetro que pasa a través de una muestra, llamamos a esto absorbancia de la muestra. La ley de Beer-Lambert relaciona la disminución de la intensidad del haz de luz del espectrofotómetro al atravesar una muestra con la absorbancia de la muestra. En otras palabras, se utiliza para medir cuánta luz se refleja/atraviesa una solución. La absorbancia de la muestra es una medida de la cantidad de luz que absorbe una muestra al atravesarla.
Montaje Experimental y Medición
Para comprender la aplicación de la ley, consideremos un dispositivo experimental. Primero, transfiere algunas de las soluciones químicas que acabas de preparar a una cubeta de cuarzo, a la que nos referiremos como cubeta de muestra. A su vez, preparas otra cubeta en la que sólo haya disolvente puro como referencia. Nos referiremos a la cubeta de cuarzo de referencia como cubeta de referencia. Como experimentador, a continuación transfieres estas dos cubetas a un espectrofotómetro, de modo que las cubetas se coloquen en las ranuras correspondientes: una en la ranura de la cubeta de muestra y la otra en la ranura de la cubeta de referencia.
La intensidad de la luz que atraviesa la célula de referencia (formada sólo por el disolvente), simbolizada por I0, se mide en cada longitud de onda, λnm, dentro del rango de longitudes de onda del espectrómetro UV-vis. A su vez, también se mide la intensidad de la luz que atraviesa la célula de muestra (disolvente más soluto), simbolizada por I, en cada longitud de onda, λnm, dentro de la gama de longitudes de onda del espectrofotómetro. La luz se propaga a través de cada célula hasta el detector del espectrofotómetro. Si en una determinada longitud de onda la intensidad luminosa que atraviesa la célula de muestra, I, es menor que la intensidad luminosa que atraviesa la célula de referencia, I0, entonces la muestra ha absorbido luz en esa longitud de onda.
Existen dos maneras de expresar la relación entre I e Io. La relación directa se denomina transmitancia (T), mientras que se denomina absorbancia al logaritmo con signo cambiado de la transmitancia. La absorbancia es un término actualmente mucho más utilizado que la transmitancia. La absorbancia de la muestra se contabiliza eliminando la absorbancia debida al disolvente.
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La Ecuación de la Ley de Beer-Lambert
Se supone que la absorbancia debida a la muestra tiene las siguientes propiedades:
- La absorbancia de la muestra, Abs, es directamente proporcional a la longitud del recorrido de la luz, la través de la cubeta.
- La absorbancia de la muestra, Abs, es directamente proporcional a la concentración de soluto, c.
En símbolos, esta relación se expresa como Abs∝l∝cl. Esta relación de proporcionalidad puede convertirse en una ecuación incluyendo una constante de proporcionalidad, que llamaremos coeficiente de extinción molar, ε lo que nos da una ecuación para la absorbancia: Abs=εcl. El coeficiente de extinción molar también se denomina absortividad molar. Esta ecuación para la absorbancia sólo puede utilizarse cuando se conoce el coeficiente de extinción molar ε.
Juntando todo esto se obtiene la ecuación de la ley de Beer-Lambert, que relaciona la atenuación, o disminución de la intensidad luminosa causada por la muestra, con el producto de la concentración de soluto, c, y la longitud del camino, la través de la cubeta: Abs=log10I0I=εcl.
Es importante destacar que la fórmula de la absorbancia, cuando no se conoce el coeficiente de extinción molar, se expresa como Abs=log10I0I. Cuando el coeficiente de extinción molar es conocido, la fórmula a utilizar es Abs=εcl.
El Coeficiente de Absortividad Molar (ε)
Para una concentración y una longitud de cubeta determinadas, la absortividad molar determina si la intensidad de la banda (absorbancia) es alta o baja. El coeficiente de absortividad molar (ε) depende del cromóforo en sí mismo, de la longitud de onda y de las condiciones de medida (pH, T...).
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Para ver la importancia del coeficiente de absortividad molar, compararemos su valor en diferentes transiciones:
| Compuesto | Transición | Longitud de Onda (λnm) | ε (l/mol·cm) | logε | Intensidad de Banda |
|---|---|---|---|---|---|
| 1,3-butadieno | $\pi \rightarrow\pi^{\ast}$ | 217 | 21000 | 4.32 | Intensa |
| Acetona | $n\rightarrow \pi^{\ast}$ | 280 | 12 | 1.08 | Muy baja (transición prohibida) |
En el caso del 1,3-butadieno se observa una banda intensa mientras que en la acetona corresponde a una banda de muy baja intensidad (transición prohibida). Es muy habitual representar $log\epsilon$ en ordenadas en lugar de la absorbancia, y en abscisas se representa la longitud de onda.
Unidades de la Ley de Beer-Lambert
Las unidades de la ley de Beer-Lambert para la concentración, c, se dan normalmente en moles por litro (mol/L) y la longitud del recorrido de la cubeta es del orden de centímetros (cm). Por tanto, las dimensiones del coeficiente de extinción ε se dan típicamente en L·mol-1·cm-1. Además, debe tenerse en cuenta que la absorbancia, Abs, es una cantidad adimensional, de modo que una absorbancia es un número mayor que cero para los picos de interés.
Las unidades de c y α (coeficiente de absorción) dependen del modo en que se exprese la concentración de la sustancia absorbente. Si la sustancia es líquida, se suele expresar como una fracción molar. Las unidades de α son la inversa de la longitud (por ejemplo cm-1). En el caso de los gases, c puede ser expresada como densidad (la longitud al cubo, por ejemplo cm-3), en cuyo caso α es una sección representativa de la absorción y tiene las unidades en longitud al cuadrado (cm2, por ejemplo).
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Gráfico de la Ley de Beer-Lambert
Utilizamos la relación I0/I para calcular la absorbancia debida a la muestra mediante la fórmula de la absorbancia: Abs=log10I0I. La fórmula de la absorbancia considera la atenuación de la luz debida a la absorción de luz del soluto en relación con la absorción del disolvente. En las longitudes de onda de interés, en las que el disolvente no absorbe apreciablemente la luz UV-vis, pero el soluto sí absorbe fuertemente la luz, la relación de intensidad, I0/I sería un número mayor que uno.
Es decir, al pasar por la célula de referencia llega más luz al detector, lo que da un valor elevado de I0 en relación con la luz que llega al detector desde la célula de muestra, que produce un valor menor de la intensidad luminosa, I, porque la muestra ha absorbido la luz que de otro modo habría llegado al detector. A continuación, los espectrogramas resultantes de la intensidad luminosa por longitud de onda se procesan y combinan para obtener un gráfico de la ley de Beer-Lambert. El trazado de la absorbancia, Abs, frente a la longitud de onda, arroja picos positivos de absorbancia de la muestra en las longitudes de onda de interés, es decir, donde la relación, I0/I es mayor que uno (I0/I >1), indicando que el soluto absorbe luz en esa longitud de onda.
Ejemplo de Aplicación: Cálculo de Actividad Enzimática
Considera el siguiente ejemplo de la ley de Beer-Lambert. Se ha preparado una solución de una enzima de interés en un tampón acuoso. Al químico le gustaría saber cómo calcular la actividad enzimática utilizando la ley de Beer-Lambert. El requisito de que haya un soluto activo UV-vis en una solución de muestra es un requisito de la espectroscopia UV-vis.
Volviendo al experimento, el químico transfiere entonces la solución de enzima tamponada a una cubeta de cuarzo; es lo que llamaremos la cubeta de referencia, que se coloca en la ranura de la cubeta de referencia del espectrofotómetro. A continuación, se transfiere otra porción de la solución enzimática tamponada a otra cubeta de cuarzo, y se añade un compuesto metabolizado por la enzima, colocando inmediatamente el conjunto en la ranura de la cubeta de muestra. Las absorbancias, Abs, de ambas cubetas se toman de forma incremental hasta que no se produzca ningún cambio en la absorbancia del metabolito.
La concentración de la solución de la muestra, c, en cada punto temporal se determina entonces mediante la ecuación de la ley de Beer-Lambert en la forma siguiente: c=Absε·l. Se trata de una forma alternativa de la ecuación de Beer-Lambert utilizada para calcular la concentración de soluto (metabolito), c, en una muestra; donde, ε es el coeficiente de extinción molar del metabolito en la solución de la muestra y, l es la longitud del recorrido de la cubeta.
Los puntos de datos calculados de la concentración de metabolito, c, se representan en función del tiempo. A continuación, se ajusta una curva a los puntos de datos dispersos. Se determina la pendiente en una región en la que la curva ajustada es lineal. Este valor de la pendiente de una región lineal de la curva ajustada es la actividad enzimática.
Limitaciones de la Ley de Beer-Lambert
A continuación se exponen algunas de las limitaciones de la ley de Beer-Lambert. La primera y más importante es que es necesario que haya un soluto UV-vis activo en la solución de la muestra para que se genere una señal de detección en un espectrofotómetro UV-vis.
Hay que tener en cuenta que las fuerzas intermoleculares entre el soluto y el disolvente pueden cambiar a medida que cambia la concentración de soluto, y estos cambios en las interacciones intermoleculares soluto/disolvente pueden afectar al gráfico de la ley de Beer-Lambert de forma no lineal. Por lo tanto, es importante elegir una longitud de onda, λnm, en el gráfico que muestre una respuesta lineal proporcional a los cambios en la concentración de soluto. Es decir, las longitudes de onda de interés muestran una respuesta lineal proporcional a los cambios en la concentración de soluto. El valor del coeficiente de absorción α varía según los materiales absorbentes y con la longitud de onda para cada material en particular.
Esta ley también se aplica para describir la atenuación de la radiación solar al pasar a través de la atmósfera. En este caso hay dispersión de la radiación además de absorción, lo que representa otra situación donde las condiciones ideales de la ley pueden no aplicarse directamente sin consideraciones adicionales.