En el ADN (ácido desoxirribonucleico) se encuentran las instrucciones que determinan todas las características y funciones de un organismo. Es el material que contiene la información genética de casi todos los seres vivos: bacterias, parásitos, animales o plantas, incluido el hombre. También es el material genético de muchos virus.
La Estructura y Función del ADN
El ADN químico se descubrió en 1869, pero su papel en la herencia genética no se demostró hasta 1943. Más tarde, en 1953, con la ayuda de los biofísicos James Watson y Francis Crick, Rosalind Franklin y Maurice Wilkins descubrieron que la estructura del ADN es un polímero de doble hélice, una hélice formada por dos hebras de ADN enrolladas un alrededor de la otra. Este avance ha permitido a los científicos comprender mejor la replicación y la regulación hereditaria de la actividad celular.
Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero formado por unidades llamadas nucleótidos. Cada nucleótido está formado a su vez por una base nitrogenada, un azúcar (la desoxirribosa) y un grupo fosfato. Las bases nitrogenadas del ADN son cuatro: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T).
Desde el punto de vista estructural, el ADN se asemeja a una escalera enrollada en espiral conocida comúnmente como doble hélice. Las moléculas de azúcar y fosfato conforman los lados de la escalera y los peldaños se forman a partir de la unión de dos bases nitrogenadas. Así, la doble hélice está conformada por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí por sus bases nitrogenadas. La unión entre bases se realiza siempre de la misma manera, cada base se une de forma complementaria: la adenina se une siempre a la timina (A-T) y la guanina lo hace siempre con la citosina (G-C). Esta estructura de doble hélice permite que, cuando sus dos cadenas se separan, cada una sirva de molde para producir una nueva cadena complementaria, proceso esencial para la replicación del ADN.
El ADN tiene la función de “guardar información”. Es decir, contiene las instrucciones que determinan la forma y características de un organismo y sus funciones. Además, a través del ADN se transmiten esas características a los descendientes durante la reproducción, tanto sexual como asexual. Ciertas zonas del ADN forman los genes que sirven como instrucciones para producir ácido ribonucleico (ARN). A su vez, la información contenida en el ARN sirve para fabricar proteínas, componentes imprescindibles para el funcionamiento de las células del organismo.
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¿Qué es la Secuenciación del ADN?
La secuenciación del ADN es una técnica de laboratorio que permite determinar el orden exacto de las bases (A, T, C o G) dentro de un fragmento de ADN. El proceso de deducir el orden de los nucleótidos en el ADN se denomina secuenciación del ADN. La secuencia de las bases (a la que se suele hacer referencia por la primera letra de su nombre químico: A, T, C y G) codifica la información biológica que las células usan para desarrollarse y funcionar. Establecer la secuencia de ADN es clave para comprender la función de los genes y otras partes del genoma.
Se podría decir que secuenciar es análogo a deletrear una palabra, frase o un texto cualquiera. En el ADN, no obstante, existe un gran apoyo para hacerlo y se basa en la complementariedad de sus 2 cadenas, de forma tal que si conseguimos “hacernos” con el deletreo de una de ellas, habremos resuelto el problema y su secuencia total habrá sido confirmada.
Principios Generales de la Secuenciación del ADN
Aunque existen diferentes métodos para secuenciar el ADN, todos ellos consisten en general en romper las largas cadenas de ADN en muchas piezas pequeñas (fragmentar el ADN), obtener la secuencia de bases de cada fragmento (el orden de las bases de nucleótidos que componen esas piezas) mediante técnicas específicas y, finalmente, utilizar programas informáticos que ensamblan de nuevo las piezas para reconstruir la secuencia original de la cadena de ADN.
Los instrumentos que utilizamos para cortar el ADN son los Enzimas de restricción (endonucleasas de restricción o restrictasas). Son proteínas, que actúan de enzimas, aisladas de bacterias que cortan ambas cadenas de ADN cuando reconocen y encuentran en él una secuencia corta concreta. Cada enzima de restriccíón es específico en el reconocimiento de la secuencia donde cortará e incluso también en la forma de realizar el corte.
Los fragmentos obtenidos deben separarse. Una electroforesis consiste en colocar una mezcla de moléculas con diferente tamaño y/o carga eléctrica en un “filtro” o soporte poroso, que puede ser un papel, en un gel o en acetato de celulosa. Este filtro se introduce en una solución y se somete a un campo eléctrico. De este modo, las moléculas se moverán por bandas más o menos rápido por el filtro según su carga y tamaño.
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La PCR (Replicación en Cadena por la acción de la Polimerasa) se basa en abrir longitudinalmente ambas cadenas (separarlas), mantenerlas abiertas durante un rato para que sobre cada una se construya su complementaria (pasamos así de 1 ADN a 2 ADNs iguales al anterior). Son necesarias muchas copias de la misma molécula para que las “señales” que se produzcan posteriormente en su deletreo (secuenciación) sean significativas y observables.
Las Primeras Técnicas de Secuenciación
Las primeras técnicas de secuenciación del ADN aparecieron ya en la década de 1970, las llamadas técnicas de secuenciación de primera generación. La determinación de las secuencias biológicas fue un problema sin resolver durante décadas hasta mediados de la década de 1970 cuando se desarrollaron métodos bioquímicos o moleculares.
El Método Maxam-Gilbert
Entre ellas se encontraba el método Maxam Gilbert, descubierto y bautizado con el nombre de dos biólogos moleculares estadounidenses: Allan M. Maxam y Walter Gilbert. El método fue desarrollado por Allan Maxam y Walter Gilbert en 1977. Se basa en dos enfoques: la escisión química de base específica del ADN y la posterior separación de los fragmentos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. El ADN se marca primero en un extremo 5 ‘o 3’ con fosfato radiactivo o una sustancia no radiactiva (biotina, fluoresceína). En cuatro preparaciones separadas, las bases específicas de la columna vertebral de azúcar-fosfato del ADN se modifican y escinden parcialmente (de forma limitada). Luego, la hebra de ADN se escinde completamente. Al comparar los cuatro enfoques en el gel, se puede leer la secuencia del ADN. Hoy en día, el método rara vez se usa porque requiere reactivos tóxicos.
El Método Sanger o Didesoxi
El segundo método, descubierto por el bioquímico inglés Frederick Sanger, era el método Sanger, también conocido como método dideoxi. El método didesoxi de Sanger también se denomina síntesis de terminación de cadena y es un método enzimático. Fue desarrollado por Sanger y Coulson alrededor de 1975. Sanger recibió el Premio Nobel de Química en 1980 por su trabajo en la secuenciación del ADN. De los dos métodos, el de Sanger se convirtió en el más utilizado porque permitía la secuenciación rápida y exacta de largas secuencias de ADN. Con el tiempo, el método dideoxi se utilizó para secuenciar todo el genoma humano.
La secuenciación Sanger utiliza nucleótidos especiales llamados didesoxinucleótidos, también conocidos como nucleótidos de "terminación de cadena". La enzima ADN polimerasa se utiliza para alargar una de las dos cadenas de ADN complementarias. El significado es que la cadena de ADN se sintetizaba en una cadena molde, pero el crecimiento de la cadena se detenía cuando se incorporaba uno de los cuatro posibles nucleótidos dideoxi, carente del grupo hidroxilo 3’, lo que impedía la adición de otro nucleótido. Esto ha creado una población de moléculas de ADN anidadas y truncadas que representan cada nucleótido del ADN molde.
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Las moléculas se separaron por tamaño, proceso conocido como electroforesis, y la secuencia de nucleótidos deducida se dedujo utilizando un ordenador. Cada didesoxinucleótido tiene una "etiqueta" fluorescente para identificar la base correspondiente A, T, C o G. El resultado de la secuenciación Sanger son copias del ADN de diferentes longitudes que se separan por tamaño en un proceso llamado electroforesis. Durante muchos años, la secuenciación Sanger ha sido el método de referencia para la secuenciación del ADN.
La secuenciación Sanger es un método muy fiable, pero solamente puede leer un fragmento corto de ADN cada vez y, además, tiene una capacidad limitada para detectar variantes presentes en proporciones muy bajas, como ocurre en tumores, donde solo algunas células llevan la variante genética patogénica, o en mosaicismo somático, donde coexisten dos líneas celulares con distinta información genética. Para que la secuenciación Sanger detecte una variante, ésta suele necesitar estar presente al menos en el 15-20% del ADN analizado.
Afortunadamente, las técnicas de electroforesis capilar y su automatización favorecieron modificaciones en el método de Sanger que perduran hasta el día de hoy: se dejó de utilizar nucleótidos radiactivos y se añadieron marcadores fluorescentes a los didesoxinucleótidos (cada uno de ellos de un color diferente). Desde luego, una técnica más visual y muchísimo más práctico, porque podemos visualizar los resultados en un único gel y con una sola reacción.
Secuenciación de Nueva Generación (NGS) o Secuenciación Masiva
Las tecnologías de secuenciación de nueva generación ya han sustituido en gran medida a las de primera generación. El Proyecto Genoma Humano, completado en 2003, necesitó más de una década usando la secuenciación Sanger para determinar el genoma de un solo individuo. Ahora es posible secuenciar el genoma humano en cuestión de horas.
Estos nuevos enfoques permiten ahora la secuenciación simultánea de muchos fragmentos de ADN, a veces millones de fragmentos. Son mucho más rentables y rápidas. Un beneficio adicional de la NGS con respecto a la secuenciación Sanger, es que es mucho más sensible para identificar variantes presentes en baja proporción: puede detectar alteraciones presentes en solo un 2-5 % del ADN analizado.
Con la capacidad actual de secuenciar grandes regiones del ADN se genera un volumen muy elevado de datos genómicos, cuyo análisis requiere el uso de algoritmos bioinformáticos avanzados. Estas herramientas permiten identificar y filtrar las lecturas obtenidas, alinearlas con un genoma de referencia, detectar las variantes presentes y anotarlas en función de su posición, el tipo de cambio, la frecuencia en población general y los predictores informáticos in silico. Finalmente, estos datos se integran para clasificar cada variante según unos criterios de puntación de patogenicidad establecidos por las guías del American College of Medical Genetics (ACMG).
Comparativa: Secuenciación Sanger vs. NGS
| Característica | Secuenciación Sanger (Primera Generación) | Secuenciación de Nueva Generación (NGS) |
|---|---|---|
| Año de Desarrollo | 1970s (método dideoxi por Sanger, 1975) | Principalmente post-2003 (masificación) |
| Fragmentos por reacción | Uno | Millones |
| Longitud de lectura | Fragmentos cortos de ADN | Mayor, aunque se ensamblan a partir de fragmentos cortos |
| Costo y Velocidad | Más costoso por base, más lento (Proyecto Genoma Humano >1 década) | Mucho más rentable y rápida (genoma humano en horas) |
| Sensibilidad de detección | Necesita estar presente al menos en el 15-20% del ADN analizado | Puede detectar alteraciones presentes en solo un 2-5 % del ADN analizado |
| Automatización y Marcaje | Inicialmente radiactivo, luego marcadores fluorescentes y electroforesis capilar | Altamente automatizada, diversas estrategias de marcaje o detección directa |
| Necesidad de amplificación PCR | Sí | Sí (generalmente, salvo en algunas de tercera generación) |
Métodos Avanzados de Secuenciación
Pirosecuenciación
La pirosecuenciación utiliza una ADN polimerasa para sintetizar la hebra contraria de ADN, aunque el tipo de ADN polimerasa aún puede variar. El ADN que se va a secuenciar sirve como una hebra de matriz y está disponible en forma de hebra única. La mezcla de ADN se liga con un adaptador de ADN y se acopla a perlas mediante una secuencia adaptadora complementaria. Las perlas cargadas con ADN se colocan en una placa con poros. La ADN polimerasa se observa «en acción» cuando une sucesivamente nucleótidos individuales a una cadena de ADN recién sintetizada. La inserción exitosa de un nucleótido se convierte en una señal luminosa que es detectada por un detector. Cuando se agrega el nucleótido apropiado, se obtiene una señal. La pirosecuenciación se ha utilizado para determinar la frecuencia de ciertos gene mutaciones, por ejemplo, en la investigación de enfermedades genéticas.
Secuenciación por Síntesis Puente (Solexa/Illumina)
Esta tecnología de secuenciación se conoce como secuenciación con síntesis puente de Solexa / Illumina. El ADN de doble hebra que se va a secuenciar se liga en ambos extremos con una secuencia adaptadora diferente en cada extremo. A continuación, el ADN se desnaturaliza y se liga a una placa de soporte en una forma monocatenaria después de la dilución. Y amplificado aún más in situ mediante amplificación puente. Esto crea áreas individuales (grupos) de ADN amplificado en la placa portadora, que tienen la misma secuencia dentro de un grupo. La reacción de PCR es con cuatro sustratos de terminación de cadena fluorescentes de diferentes colores.
Secuenciación por Detección de Ligadura de Oligo (SOLiD)
Secuenciación por detección de ligadura de oligo (Sólido) de Applied Biosystems es una variante de Secuenciación por ligadura. Una biblioteca de ADN se diluye y se acopla a microperlas con una ADN polimerasa. Luego, el ADN se amplifica en una PCR en emulsión. Por tanto, cada microperla contiene varias copias de una única secuencia de ADN. Después de la unión del cebador, se añaden cuatro sondas escindibles diferentes, cada una de las cuales está marcada con un color fluorescente diferente. Se unen a la plantilla de ADN por medio de los dos primeros nucleótidos (CA, CT, GG, GC). A continuación, las microperlas se ligan con una ADN ligasa. A continuación, las sondas se escinden, liberando así las etiquetas.
Tecnología Ion Torrent
El método Ion Torrent utiliza tecnología de chips semiconductores para realizar la secuenciación directa del genoma no óptica utilizando circuitos integrados. Los datos de secuenciación se obtienen directamente de la detección de iones producidos por ADN polimerasas dependientes de molde. El chip semiconductor utilizado en este método tiene un transistor de efecto de campo sensible a los iones. Sus sensores están dispuestos en una cuadrícula de 1,2 millones de pozos en los que tiene lugar la reacción de la polimerasa.
Secuenciación de Tercera Generación
Por primera vez, la secuenciación de tercera generación mide la reacción en moléculas individuales como un experimento de una sola molécula. Esto elimina la necesidad de amplificación por PCR antes de la secuenciación. Las polimerasas muestran un sesgo de unión a algunas secuencias de ADN. Por tanto, esto evita la amplificación desigual por las ADN polimerasas termoestables. Además, se puede examinar el genoma de una célula individual. La señal liberada se registra en tiempo real. En la secuenciación de ADN de tercera generación, se registran dos señales diferentes, según el método utilizado. Son protones o fluoróforos liberados.
Secuenciación por Nanoporos
Secuenciación de nanoporos se basa en cambios en el flujo de iones a través de nanoporos incrustados en una membrana creada artificialmente. Los nanoporos son poros biológicos o sintéticos o incluso poros semisintéticos. Las moléculas de ADN que atraviesan el poro provocan una reducción de la corriente. Esta reducción de corriente tiene una amplitud específica para cada nucleótido, que se puede medir y asignar al nucleótido correspondiente. En la secuenciación de una sola hebra, una helicasa separa una hebra de ADN de doble hebra y se introduce en el nanoporo. Los cambios de corriente de iones específicos para cada uno de los cuatro nucleótidos permiten leer la secuencia. La ventaja de este método es que tiene una precisión constante incluso con cadenas largas de ADN. La tecnología de secuenciación de nanoporos está siendo avanzada por la empresa británica Oxford Nanopore Technologies.
Aplicaciones de la Secuenciación del ADN
Conocer la secuencia de los segmentos de ADN tiene muchas utilidades. Las diferencias en la secuencia de los aproximadamente 3,2 mil millones de pares de bases del genoma humano explican la variación genética entre las personas. En medicina, la secuenciación del ADN tiene diversas aplicaciones, incluidas el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades hereditarias.
En primer lugar, puede utilizarse para identificar los segmentos de ADN que codifican genes o fenotipos. Cuando se secuencia una región concreta de ADN, puede utilizares para buscar los rasgos característicos de los genes. En segundo lugar, pueden compararse secuencias de ADN homólogas de distintos organismos para trazar relaciones evolutivas dentro de cada especie y entre especies. En tercer lugar, se puede examinar la secuencia de un gen en busca de regiones funcionales. Es decir, para determinar la función de un gen, se pueden identificar distintas regiones comunes a proteínas con funciones similares.
Hay una amplia variedad de aplicaciones médicas para la secuenciación de ADN. Estas técnicas se pueden usar para evaluar un gen o varios genes con la finalidad de ayudar a diagnosticar enfermedades hereditarias. En general, la secuenciación permite a los profesionales sanitarios determinar si un gen o la región que regula un gen contiene cambios, llamados variantes genéticas causales, que están asociadas a un trastorno de origen genético. Se sabe que algunos cambios causan problemas con la estructura o la función de un gen o de su proteína, y estos se conocen como variantes genéticas causantes de enfermedades o variantes patogénicas.
Algunas de las aplicaciones específicas incluyen:
- Secuenciación dirigida: Secuenciación de regiones concretas de uno o varios genes donde se conocen variantes genéticas causantes de enfermedad. Ejemplos incluyen la secuenciación de variantes patogénicas concretas en el gen BRAF en muestras de biopsias de tejido de melanoma para orientar terapias dirigidas, o la secuenciación de un gen completo como el gen FBN1, asociado al síndrome de Marfan, donde se han descrito más de 1.000 variantes diferentes.
- Secuenciación de un panel de genes: Secuenciación de múltiples genes asociados a un trastorno genético o cuadro clínico concreto. Un ejemplo es un panel para secuenciar los genes MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 y EPCAM asociados al síndrome de Lynch, un trastorno hereditario que aumenta el riesgo de muchos tipos de cáncer.
- Secuenciación del exoma clínico: Incluye el análisis de aproximadamente unos 6.000 genes asociados a un cuadro clínico conocido y que, a día de hoy, se sabe que causan alguna enfermedad en el ser humano, tanto de inicio muy temprano (durante la gestación) como en edades adultas tardías.
- Secuenciación del exoma completo o secuenciación del genoma completo: Estas técnicas son mucho más complejas tanto en el análisis como en la interpretación de los resultados y se suelen usar en casos con un cuadro clínico complejo y/o solapante con otros trastornos. Normalmente, se emplean después de que otras pruebas no hayan revelado un diagnóstico (exoma completo) o en investigación (genoma completo).
- Secuenciación del genoma completo de los microorganismos: La secuenciación del genoma completo se puede utilizar para secuenciar los genomas de otros organismos. Un ejemplo es la secuenciación de los genomas de bacterias en brotes epidémicos. Al comparar secuencias de bacterias e identificar diferencias, los científicos de salud pública pueden determinar lo estrechamente que están relacionadas las bacterias y cuán probable es que formen parte del mismo brote.
A medida que las tecnologías de secuenciación del ADN avanzan, su uso en medicina y salud pública seguirá creciendo.